Биотрансформация этанола в изолированных гепатоцитах

Метаболизм этанола в печени является наглядным примером су­ществования сложного и тонко отрегулированного взаимодействия полиферментных систем различных компартментов органелл клет­ки в биотрансформации веществ. Благодаря исследованиям в по­следние 15 лет установлено, что этанол, введенный в организм в низких концентрациях (до 2мМ) быстро метаболизируется в печени; 75-95% его окисляется в па­ренхиматозных клетках. Основной путь его деградации связан с алкогольдегидрогеназой (АДГ) — ферментом, находящимся в рас­творимой части цитозоля и ответственным за конверсию этанола в ацетальдегид в присутствии НАД⁺. Ацетальдегид окисляется до ацетата альдегиддегидрогеназой, локализованной в митохондри­альном компартменте.

Благодаря этому контроль за окислением этанола осуществляется, во-первых, активностью АДГ; во-вторых, транслокацией восстановительных эквивалентов из цитозоля в митохондрии; в-третьих, окислением в митохондриях восстановительных эквивалентов кис­лородом. В зависимости от экспериментальных условий каждый фактор может быть лимитирующим для метаболизма этанола.

В нормальных условиях дальнейший метаболизм ацетальдегида в митохондриях происходит очень быстро, со скоростью 10 нмоль в мин^-1 на мг^-1 белка, и лимитирующим звеном всей реакции в целом является окисление этанола до ацетальдегида, которое зави­сит от диссоциации комплекса фермент — НАДН. В интактной пе­чени эта диссоциация регулируется уровнем цитозольного НАД⁺, который лимитирует скорость всего процесса метаболизма этанола. Его реокисление связано с работой шунтов, обеспечивающих пере­нос восстановительных эквивалентов в митохондриальный компартмент. Согласно мнению боль­шинства исследователей, основная роль в этом процессе при окисле­нии этанола отводится малат-аспартатному и альфа-глицерофосфатному шунтам. Максимальная ско­рость окисления этанола в изолированных гепатоцитах обеспечивается высокой концентрацией интермедиатов шунтов, в том числе глутамата, аспартата и глицерол-3-фосфата. Увеличение их концентрации в гепатоцитах повы­шает соответственно метаболический поток через каждый шунт. В обычных условиях мощность обоих шунтов в гепатоцитах крыс примерно одинакова.

Потеря глутамата и аспартата при выделении гепатоцитов мо­жет сказываться на активности малат-аспартатного шунта, снижая ее. Возможно, именно этим объясняется отрицательный вывод Берри и Куна о роли малат-аспартатного шунта в метабо­лизме этанола. Однако в процессе инкубации происходят медленная регенерация интермедиатов шунта и относительное восстановление его активности. Различия в концентрации интер­медиатов шунтов у сытых и голодных животных определяют осо­бенности метаболизма этанола в этих двух состояниях (скорость окисления этанола у сытых в 1,5 раза больше, чем у голодных). Благодаря ограниченной транспортной способности шунтов отношение НАДН/НАД⁺ в цитозоле резко увеличивается во время метаболизма этанола, а именно это перевосстановление, возможно, ответственно за эффекты, связанные с длительным введением алко­голя в организм.

Дополнительно к АДГ существуют по крайней мере еще две системы, которые участвуют в окислении этанола. В присутствии перекиси водорода, как известно, каталаза катализирует окисле­ние как метанола, так и этанола до соответствующих альдегидов.

Так как Н₂О₂ является естественным продуктом, образующим­ся в нормальных физиологических условиях в различных метабо­лических путях в клетке, включая бета-окисление жирных кислот, а также аутооксидацию цитохрома Р-450, окисление этанола в гепа­тоцитах может происходить за счет активации пероксидазной функ­ции каталазы. Этот зависимый от каталазы путь окисления этанола является дополнительным к основному, АДГ-зависимому. Действие этого механизма наглядно демонстрируется на гепатоцитах в присутствии высоких концентраций аминооксиацетата, который в этом случае не выполняет функцию ингибитора аминотрансфераз, а активно метаболизируется в гликолат. По­следний, являясь субстратом пероксисом, генерирует Н₂О₂, которая стимулирует окисление этанола как в каталазной реакции, так и за счет окисления цитоплазматического НАД в глиоксилатной реакции, что приводит к вторичной активации АДГ. Таким образом, в присутствии гликолата или высоких концентраций аминооксиацетата наблюдается стимуляция окисления этанола. Поэтому, хотя участие каталазы в метаболизме этанола в обыч­ных условиях невелико, ее роль может резко усилиться при уве­личении генерации перекиси водорода в клетке.

На протяжении более чем 15 лет дискутируется возможность участия в метаболизме этанола так называемой микросомальной этанолокисляющей системы (МЭОС), которая является НАДФН- и цитохром Р-450-зависимой.

Ее функция не связана с пероксидазной активностью каталазы, как это считалось одно время. Есть мнение, что существует специальная форма цитохрома Р-450, которая активируется при окислении этанола. Вполне возможно, что эта реакция медиируется гидроксильным радикалом (ОН), генерируемым системой цитохрома Р-450, как это было показано Цедербаумом и другими. Окончательного решения этого вопроса на сегодняшний день пока еще нет.

Наряду с этим имеется экспериментально подтверждаемая ги­потеза, что в последней реакции органические гидроперекиси мо­гут замещать НАДФН и также поддерживать окисление этанола, длинноцепочечных и вторичных спиртов. Этот механизм не связан с инициацией гидроксильных радикалов и не чувствителен к его скэвенджерам, так же как и к ингибиторам НАДФН-зависимого окисления. В связи с этим предполагается, что в зависимости от используемого механизма (НАДФН-зависимой систе­мы или органических гидроперекисей) в реакции могут участво­вать различные изоэнзимы цитохрома Р-450.

Действие этанола на редокс-состояние клетки, с одной сторо­ны, и участие НАДФН-зависимой ферментной системы в его окис­лении — с другой, предопределяет возможность взаимовлияния метаболизма этанола и ксенобиотиков. Как правило, оно выража­ется в ингибирующем действии этанола на различные реакции биотрансформации других веществ. Эти взаимодействия интенсив­но изучаются на гепатоцитарной модели.

Уменьшение отношения НАД⁺/НАДН, возникающее при мета­болизме этанола в реакции, катализируемой АДГ, влияет на об­щий редокс-потенциал клетки, в результате чего могут произойти ингибирование цикла Кребса и бета-окисления жирных кислот, а так­же последующее опосредованное уменьшение транспорта восста­новительных эквивалентов из митохондрий в цитозоль, что в ко­нечном счете будет отрицательно сказываться на работе НАДФН-зависимых систем окисления гепатоцита. Уве­личение митохондриального НАДН может непрямым образом так­ же влиять на скорость генерации НАДФН в пентозо-фосфатном цикле.

Известны примеры отрицательного действия метаболизма эта­нола на различные реакции II стадии биотрансформации веществ, в том числе глюкуронидацию. В то же время этанол активирует реакции ацетилирования сульфаниламида (но не прокаинамида) в гепатоцитах, благодаря тому что он увеличивает концентрацию ацетил-КоА в цитозоле, необходимого для этого процесса.

Вторая стадия биотрансформации веществ в изолированных гепатоцитах

Метаболиты, образованные во время I стадии биотрансформа­ции, могут подвергаться дальнейшим превращениям с помощью целого ряда реакций II стадии. Как правило, при этом образуются более полярные и менее токсичные соединения, которые доста­точно легко выводятся из клетки. Однако часть липофильных ксе­нобиотиков является субстратами исключительно только этой ста­дии и метаболизируются, минуя I стадию. Известны пять основ­ных типов реакций, относящихся ко II стадии биотрансформации, причем часть из них являются энергозависимыми.

Жизнеспособные гепатоциты интенсивно используются для изучения всех реакций II стадии биотрансформации ксенобиотиков.

Врачи и исследователи подчеркивают важность изучения биотрансформации этанола в изолированных гепатоцитах для понимания метаболизма алкоголя и его воздействия на печень. Изолированные гепатоциты позволяют детально анализировать процессы, происходящие на клеточном уровне, что способствует выявлению механизмов токсичности этанола. Специалисты отмечают, что в ходе биотрансформации этанол превращается в ацетальдегид, который является более токсичным соединением и может вызывать повреждение клеток печени. Кроме того, исследования показывают, что индивидуальные различия в активности ферментов, участвующих в метаболизме этанола, могут объяснять различную восприимчивость к алкогольной болезни. Врачи акцентируют внимание на необходимости дальнейших исследований, чтобы разработать эффективные методы профилактики и лечения заболеваний печени, связанных с алкоголем.

Пути метаболизма этанола в печени | Биохимия

Глюкуронидация

Конъюгация веществ с глюкуроновой кисло­той широко распространена при биотрансформации веществ. Суб­стратами реакций являются как продукты I стадии, так и вещест­ва, метаболизирующиеся только с помощью этой реакции (различ­ные спирты, карбоновые кислоты, ряд эндогенных субстратов, как, например, билирубин и стероидные гормоны). Продукты этой ре­акции являются полярными соединениями и поэтому легко выво­дятся из клетки. Они, как правило, менее токсичны, нежели ис­ходные неконъюгированные продукты I стадии. Исключение составляют бета-глюкурониды некоторых канцерогенных ариламинов. Образование конъюгатов катализируется ферментом глюкуринилтрансферазой, который обеспечивает превращения УДФ-альфа-D-глюкуроновой кислоты до бета-D-глюкуронида. В гепато­цитах, в которых глюкуронилтрансферазная активность сущест­венно выше, чем в других клетках, фермент локализован в эндоплазматическом ретикулуме и оболочке ядра. Скорость глюкуронидации в изолированных гепатоцитах сравнима со скоростью это­го процесса в микросомах. Реакция индуцируется как фенобарбиталом, так и 3-метилхолантреном и ингибируется салициламидом. Индуктором этого фермента яв­ляются глюкокортикоиды, а УДФ-N-ацетилглюкозамин постули­руется в качестве возможного регулятора трансферазной актив­ности в гепатоците.

Активность УДФ-глюкуронилтрансферазы зависит от генера­ции кофакторов в различных субклеточных компартментах. УДФ-глюкуроновая кислота образуется из УТФ и глюкозы в последо­вательной цепи реакций, одна из которых является НАД⁺-зависимой. Поэтому увеличение отношения НАДН/НАД⁺ в цитозоле инициирует эту реакцию и может уменьшать синтез УДФ-глюкуроновой кислоты. Этот механизм был постулирован, чтобы объяснить снижение образования глюкуронидов в изолированных гепатоцитах под влиянием этанола.

Конъюгация чужеродных соединений с глутатионом

Конъюгация чужеродных соединений с глутатионом в гепато­цитах используется чрезвычайно широко. Процесс катализируется группой мультиферментов — глутатион-S-трансфераз, обладающих широкой субстратной специфич­ностью. Они участвуют также в связывании гидрофобных соеди­нений и играют большую роль в поддержании глутатионпероксидазной активности. В гепатоцитах глутатион-S-трансферазы найдены в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях и оболочке ядра. Их концентрация в цитозоле очень высока и в некоторых состояниях может составлять до 10% от содержания общих растворимых белков печени крысы. На глутатион-S-трансферазную активность сильно влияет гормональный статус животного, некоторые индукторы ферментов, включая фенобарби­тал и полициклические углеводороды, а также антиоксиданты.

Глутатион-S-конъюгаты — полярные соединения, легко экскретируемые из клетки. Однако перед этим большинство из них метаболизируются до соответствующих меркаптанов с промежуточ­ным образованием цистеинилглицина, цистеина и N-ацетилцистеин-S-конъюгатов. Гепатоциты широко используются для изучения этого процесса. На сегодняшний день хорошо изучен метаболизм анальгетика парацетамола, биотрансформация которо­го в клетках печени приводит к образованию тиоловых конъюга­тов глюкуроновой кислоты в качестве основных метаболитов. Од­нако в результате взаимодействия парацетамола с системой ци­тохрома Р-450 могут образовываться также электрофильные ме­таболиты, которые инактивируются затем в реакциях конъюгации с GSH. Образование тиоловых конъюгатов в изолированных клет­ках печени используется в качестве меры интенсивности метабо­лизма парацетамола системой цитохрома Р-450. В гепатоцитах, полученных от животных, индуцированных фенобарбиталом и 3- метилхолантреном, утилизация GSH во время метаболизма пара­цетамола является показателем их способности к его ресинтезу.

Биотрансформация этанола в изолированных гепатоцитах является важной темой в области токсикологии и фармакологии. Исследования показывают, что гепатоциты, обладая высокой метаболической активностью, способны эффективно преобразовывать этанол в менее токсичные соединения. Ученые отмечают, что этот процесс включает в себя как окислительные, так и неокислительные пути, что позволяет организму адаптироваться к различным концентрациям алкоголя.

Модели, использующие изолированные гепатоциты, позволяют детально изучить механизмы метаболизма и выявить факторы, влияющие на скорость биотрансформации. Например, влияние генетических полиморфизмов, а также взаимодействие с другими веществами, такими как лекарства или токсины, может существенно изменять эффективность метаболизма.

Многие исследователи подчеркивают, что понимание этих процессов имеет важное значение для разработки новых терапевтических стратегий и оценки рисков, связанных с употреблением алкоголя. В целом, работа с изолированными гепатоцитами открывает новые горизонты для изучения метаболизма этанола и его последствий для здоровья человека.

Биохимия | Метаболизм этанола

Сульфатация

Для большинства ксенобиотиков глюкоронидация и сульфатация являются альтернативными процессами. Это хорошо показано на изолированных гепатоцитах. В процессе био­трансформации очень многие ксенобиотики (экзогенные и эндо­генные липофильные фенолы, спирты, гидроксиламины, большин­ство стероидов) образуют сульфатконъюгированные эфиры. Сульфатконъюгаты, как правило, менее реактивны и токсичны, чем их предшественники, хотя имеются исключения, как, например, ацетиламинофлоурен. Реакция катализируется разными сульфаттрансферазами, которые представляют собой мембраносвязан­ные белки и компартментализованы в цитозоле. Как правило, они неиндуцибельны, но на их активность влияют функциональное со­стояние животного, пол, возраст, гормональный статус.

Активированная форма сульфатконъюгата 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфат (PAPS) является кофактором сульфаттрансферазных реакций и образуется из АТФ, неорганического фосфата и неорганического сульфата. Она используется также в качестве донора в различных биосинтетических путях, катализируемых мембраносвязанными ферментами, как, например, при образова­нии сульфатированных гликопротеидов и полисахаридов. Реакция сульфатации полностью сохраняется в изолированных гепатоцитах. Так же как и в изолированной перфузируемой печени, она лимитируется неорганическим сульфа­том и поэтому может быть усилена его добавлением в инкубаци­онную среду. Сульфат может быть заменен цистеином, который конвертирует в неорганический сульфат в реакции, инициирован­ной цистенноксигеназой.

N-ацетилирование ксенобиотиков представляет собой процесс конъюгации веществ с активной формой ацетила. Эта реакция представляет особый фармакологический и токсикологический ин­терес, так как существует чрезвычайно широкая индивидуальная вариабельность в скорости ацетилирования веществ у человека и некоторых видов животных. Она связана с генетически обуслов­ленным полиморфизмом ацетил-КоА-зависимой ацетилтрансферазы, локализованной в цитозоле гепатоцитов. Фермент катализиру­ет ацетилирование ариламинов и гидразинов до аминов. С помощью ацетилирования, минуя I стадию биотрансформации, метаболизируется также большинство сульфаниламидов и n-аминобензойная кислота. Эта реакция специфична для паренхиматозных клеток печени. Для реакции необходима ацетилированная форма коэнзима, который регенерирует в цитозоле из цитрата под влиянием фермента цитратлиазы в АТФ-зависимой реакции. Механизмы реакций ацетилирования полностью сохраня­ются в изолированных гепатоцитах.

Регуляторами процесса в интактных клетках могут быть пред­шественники ацетил-КоА, влияющие на его ресинтез в цитозоле, и связанный с ним перенос цитрата через митохондриаль­ную мембрану, а также степень энергизации клетки. Снижение энергетического пула клетки приводит к подавлению этой реак­ции. Скорость ацетилирования при истоще­нии пула АТФ в гепатоцитах снижается в 5 раз и составляет всего 18% от максимальных значений. Скорость же образования n-аминофенола из анилина в аналогичной ситуации уменьшается всего на 25%. Частичная зависимость последней реакции от концентра­ции АТФ может быть объяснена тем, что некоторая часть анилина (20-30%) после его транс­формации до n-аминофенола в цитохром Р-450-зависимой ре­акции может также подвер­гаться ацетилированию.

Ацетилирование стрептоци­да в гепатоцитах, как и следо­вало ожидать, не зависит от содержания цитохрома Р-450 и остается линейным в течение 1,5-2ч инкубации в отличие от анилина, скорость превращения которого во вре­мени протекает параллельно уменьшению содержания цитохрома Р-450 в гепатоцитах.

Наконец, следует упомянуть еще об эпоксидгидролазной ре­акции. Микросомальная эпоксидгидролаза была обнаружена срав­нительно недавно. Она катализирует трансформацию электрофильных эпоксидов до соответствующих дигидродиолов путем нук­леофильной атаки перекисью водорода или гидроксильным ради­калом молекулы вещества на противоположной эпоксидному коль­цу стороне. Прямым продуктом этой реакции также являются ме­нее токсичные и реактивные соединения. Однако ситуация ослож­няется тем, что образованные дигидродиолы могут снова посту­пать в цитохром Р-450-зависимую реакцию и образовывать дигидродиоловые эпоксиды, значительно более токсичные, чем исходные вещества. В гепатоцитах эпоксидгидролазная реакция показана, например, при метаболизме бензо-альфа-пирена.

Следует отметить, что частным случаем биотрансформации ве­ществ является одновременное включение различных реакций их превращений. Так, например, метаболические превращения бензо-альфа-пирена в гепатоцитах начинаются с НАДФН-цитохром Р-450-редуктазной реакции, а образующиеся промежуточные продукты служат субстратами реакций глюкуронидации, сульфатации, обра­зуют эпоксиды, дигидродиолы. Часть этих веществ может снова метаболизироваться в системе цитохрома Р-450.

Другим примером является парацетамол. Его биотрансформа­ция в гепатоцитах приводит к образованию сульфатконъюгатов и конъюгатов глюкуроновой кислоты в качестве основных метаболи­тов. Однако в результате взаимодействия парацетамола с цито­хром Р-450-зависимой системой образуются и электрофильные ме­таболиты, идентичные иминохинону, которые инактивируются конъюгацией с GSH.

Вопрос-ответ

Метаболизм этанола

Как происходит окисление этанола в печени?

Этанол → Ацетальдегид → Уксусная кислота В печени происходит промежуточное превращение (окисление) этилового спирта в ацетальдегид с помощью фермента алкогольдегидрогеназы, а затем идет превращение ацетальдегида в уксусную кислоту с помощью фермента ацетальдегиддегидрогеназы.

Как этанол метаболизируется в организме?

Химический распад алкоголя Некоторые из этих промежуточных метаболитов могут оказывать вредное воздействие на организм. Большая часть этанола в организме расщепляется в печени ферментом, называемым алкогольдегидрогеназой (АДГ), который превращает этанол в токсичное соединение, называемое ацетальдегидом (CH3CHO), известный канцероген .

Как этанол влияет на печень?

Этиловый спирт провоцирует превращение жирных кислот в жиры и накопление их в печени. При стеатозе у человека иногда наблюдаются тяжесть в животе, боли в области печени, слабость, тошнота, потеря аппетита, хуже переваривается жирная пища.

Какой фермент метаболизирует большую часть этанола в печени?

Алкоголь не может накапливаться. Его небольшое количество деградирует при пассаже через слизистую желудка, но основная часть метаболизируется в печени, в первую очередь с помощью алкогольдегидрогеназы (АДГ), но также и цитохрома Р-450 2Е1 (CYP2Е1) и микросомальной системы этанолового окисления (MEOS).

Советы

СОВЕТ №1

Изучите механизмы биотрансформации этанола, чтобы лучше понять, как он влияет на клетки печени. Это поможет вам осознать важность гепатоцитов в метаболизме и детоксикации веществ.

СОВЕТ №2

Обратите внимание на условия изоляции гепатоцитов, так как они могут существенно влиять на результаты экспериментов. Используйте свежие и качественные образцы, чтобы обеспечить точность ваших данных.

СОВЕТ №3

Проводите контрольные эксперименты с различными концентрациями этанола, чтобы оценить его влияние на метаболизм гепатоцитов. Это поможет вам выявить дозозависимые эффекты и лучше понять токсичность этанола.

СОВЕТ №4

Не забывайте о важности анализа полученных данных с использованием статистических методов. Это позволит вам подтвердить достоверность ваших выводов и сделать обоснованные заключения о биотрансформации этанола.